توضیحات

پروژه شبیه سازی سیستم میکروفلوئیدیک برای جداسازی سلول های سرطانی در گردش در کامسول

دانلود مقاله مرجع

 

در سال های اخیر تعداد بیمارانی که به علت ابتلا به بیماری سرطان از دنیا می روند رو به افزایش می باشد؛ که در این بین ایران بیشترین رشد ابتلا به سرطان را در جهان دارا می باشد. از این رو، تلاش­های بسیاری برای کنترل این بیماری شده است که در اکثر این موارد پزشکان معتقدند تشخیص به موقع این بیماری مهمترین فاکتوری می باشد که درمان سرطان را امکان پذیر می کند. برای تشخیص بیماری سرطان روشهای بسیاری ابداع شده است. تعدادی از این روش ها با بررسی بافت سرطانی و عکس برداری سرطان را تشخیص می دهند که روش های تخریبی می باشند. در روش جدیدی که محققان ابداع کرده اند تعداد سلول های سرطانی در گردش در سیستم گردش خون مورد بررسی قرار می گیرد. در یک میلی لیتر خون تنها ۱۰ تا ۱۵ سلول سرطانی در گردش موجود می باشد که عملا شمارش آن ها را بسیار پیچیده می نماید. محققان امیدوارند بتوانند با کشف توالی ژنوم این سلول های سرطانی در گردش، برای هدف قرار دادن سلولهای سرطانی هر بیمار روش منحصر به فردی را بکار ببرند. رسیدن به این هدف در آینده نزدیک ممکن نیست اما دانشمندان موفق به ساخت دستگاهایی شده اند که نوعی مسیر میانبر را فراهم کرده است. این دستگاه ها با استفاده از نیروی الکتریکی مغناطیسی امواج صوتی و … سلول های سرطانی در حال گردش را از سلول های خونی جدا می کند. ساخت این دستگاه ها رسیدن به هدف شخصی سازی درمان سرطان با استفاده از توالی ژنوم سلول های سرطانی را بسیار دست یافتنی تر کرده است.

البته سرطان شناسی هم اکنون ابزار دیگری برای جدا کردن سلول های سرطانی از نمونه خون در اختیار دارد. اما تمام این روش های از آنتی بادی یا پادتن هایی استفاده می کنند که مستقیما به سلول های سرطانی می چسبند. به این ترتیب پزشکان ابتدا باید سرطان و نوع آن را بشناسند و سپس سلول های آن را در خون شناسایی کنند. این روش ها ژن های سلول های سرطانی را هم تغییر می دهند و به همین  خاطر هدف قرار دادن سرطان با روش های درمانی دقیق دشوار می شود.

خون:

خون مایع اصلی داخل بدن می باشد که وظیفة اصلی آن رساندن اکسیژن و مواد مغذی به سلول ها، دفع مواد زائد و دفاع از بدن می باشد. علاوه بر این خون به عنوان یک بافت نیز نامیده می شود به دلیل اینکه خون از مجموعه ای از سلول ها تشکیل شده است که هرکدام وظيفه خاصی را بر عهده دارند. در حدود ۷ الى 8 درصد وزن بدن را خون تشکیل می دهد و در انسان بالغ به طور متوسط ۵ لیتر از حجم بدن را خون تشکیل می دهد. به طور کلی خون یک سیال غیرنیوتونی است که از 55 درصد حجمی پلاسما و 45 درصد حجمی سلول تشکیل شده است.

پلاسما:

پلاسما مایع زردرنگی است که در حدود 55% حجمی خون را تشکیل می دهد. پلاسما از 91 درصد آب، 7 درصد پروتئین ها، 1 درصد املاح معدنی و 1 درصد باقیمانده شامل ویتامین ها، مواد قندی و مواد لیپیدی، هورمون ها و اسیدهای آمینه می شود.

گلبول های قرمز:

گلبول های قرمز دارای بیشترین فراوانی در مقایسه با بقیة سلول های خونی می باشند. قطر گلبول های قرمز بالغ در حدود 6 تا 8 میکرومتر است که به صورت میانگین 7.6  میکرومتر در نظر گرفته می شود. غلظت این سلول ها در خون مردان و زنان بالغ به ترتیب برابر با 3.6 تا 5.5 میلیون و 4.1 تا 6 میلیون بر میکرولیتر می باشد.

هماتوکریت به درصد حجمی این گلبول ها در داخل خون می باشد که در مردان و زنان بالغ به ترتیب برابر با 45 درصد و 40 درصد است.

گلبول های سفید:

گلبول های سفید به صورت تقریبی 1 درصد حجمی خون را تشکیل می دهند. گلبول های سفید، که خود به 5 دسته تقسیم می شوند، وظیفه دفاع از بدن در مقابل بیماری ها را برعهده دارند. به طور کلی در افراد سالم غلظت این سلول ها در داخل خون بین 4000 تا 11000 عدد بر میکرولیتر است.

سلول های سرطانی در گردش:

سلول های سرطانی در گردش سلول هایی هستند که از یک بافت سرطانی جدا شده اند و در داخل خون جریان دارند. به این مرحله از بیماری سرطان در اصطلاح متاستاز گفته می شود. سلول ها می توانند به وسیله جریان خون به بافت های حیاتی بدن بروند. این رویه یکی از رایج ترین روش هایی است که سرطان سبب مرگ فرد می شود.

سلول های سرطانی در گردش اولین بار توسط آشورت در سال 1869 در جریان خون فردی که مبتلا به سرطان متاستاز بوده، مشاهده شد. مطابق نتیجه گیری آشورت این سلول ها دلیل ایجاد تومورهای سرطانی در مکان های مختلف در بدن بیمار می باشند. اهمیت مطالعه سلول های سرطانی به دهه 1990 برمی گردد. در این دهه آلارد و همکارانش سلول های سرطانی در گردش در خون را در مراحل ابتدایی سرطان متاستاز مشاهده کردند. از آن پس بسیاری از تکنولوژی ها برای شمارش و شناسایی سلول های سرطانی مورد استفاده قرار داده شده است. روش مرسوم در بررسی بیماری سرطان نمونه برداری است.

نمونه برداری از بیمار از معایبی رنج می برد که ضرورت توسعه روش های نوین در این زمینه احساس می­گردد. نمونه برداری یک روش مخرب است و نمی تواند بیمار چندین نمونه برداری را تجربه کند. علاوه بر این نمونه برداری نمی تواند معیاری را برای مفید بودن روش درمان و همچنین پیشرفت بیماری را ارائه دهد. در حالی که نمونه برداری از خون مزایای بسیاری دارد که می توان به بررسی پیشرفت بیماری، راستی آزمایی روش معالجه، قابلیت تکرار آزمایش و غیر مخرب بودن آزمایش اشاره کرد. مشکل پیش رو در شمارش سلول های سرطانی در گردش در خون تعداد بسیار معدود آنها در مقایسه با سلول های دیگر است. به طور تقریبی در هر میلی لیتر خون فرد مبتلا به سرطان در مرحله متاستاز کمتر از ۵۰ سلول سرطانی در گردش وجود دارد.

روش های مورد استفاده در جداسازی سلول های سرطانی در گردش در داخل خون:

جداسازی و مرتب سازی سلول هایی که در بستر میکروسیالی قرار دارند در شاخه های مختلف پزشکی نظير سرطان شناسی و مطالعه سلول های بنیادی کاربرد دارند. جداسازی سلول های هدف از خون یکی از رایجترین و موثرترین روش ها در زمینه های تشخیصی و درمانی می باشد. در این زمینه جداسازی سلول هایی که کمترین تعداد را دارند در تشخیص بیماری های کشنده ای نظیر مالاریا، سرطان، و اچ.آی.وی نقش اصلی را بازی می کنند. به عنوان مثال، جداسازی سلول های سرطانی سرگردانی از خون در تشخیص بیماری سرطان در مرحله متاستاز و مرحله کنترل بیماری کاربرد دارد.

روش های جداسازی سلول های سرگردان سرطانی بطور کلی به دو دسته کلی زیر تقسیم می گردند:

روش های فعال:

در روش های فعال برای جداسازی ذرات از یک میدان نیروی خارجی استفاده می شود. روش های فعال برحسب ماهیت نیرویی که برای جداسازی ذرات از آن بهره می برند به چهار دسته کلی تقسیم می شوند:

دی الکتروفورسیس، ، مگنتوفورسیس، آكوستوفورسیس، و چنگال های نوری.

روش های غیرفعال:

در روش های غیر فعال بر خلاف روش های فعال از نیروی خارجی برای جداسازی استفاده نمی شود. در این نوع جداسازی، مکانیزم مورد استفاده هندسه و نیروهای غیرخطی هیدرودینامیکی هستند. در این روش ذرات با توجه به تفاوت در خواص فیزیکی از جمله چگالی، اندازه و شکل پذیری از یکدیگر جدا می شوند. باریکه جریان خارجی، فیلتراسیون هیدرودینامیکی، و جابجایی عرضی معین می باشند. هرکدام از روش های مطرح شده مزایا و معایب خاص خود را دارند که در هر کدام در بعضی کاربردها می توانند مورد استفاده واقع شوند.

بازده جداسازی و سرعت جداسازی:

بازده جداسازی عبارت است از تعداد سلول های سرطانی جداسازی شده به تعداد کل سلول های سرطانی در خون

سرعت جداسازی عبارت است از حداکثر دبی ورودی به خون برای جداسازی سلول های سرطانی(معمولاً در این روش ها، اگر دبی از حدی بیشتر گردد یا به سلول های سرطانی به علت وارد شدن تنش برشی زیاد آسیب می رسد و یا بازده دستگاه پایین می آید).

امروزه به علت افزایش روز افزون ابتلا به بیماری سرطان در کل جهان، روش های مختلفی برای تشخیص و درمان این بیماری ابداع شده است. در این بین همانطور که بیان گردید، یکی از مهمترین این روش ها که اخیراً ابداع گشته است، تشخیص بیماری سرطان با استفاده از جداسازی سلول­های سرطانی در گردش در یک میلی لیتر خون فرد می باشد. در این بین روش های بسیار زیادی برای جداسازی سلول های سرطانی در حال گردش ارائه شده است، که به طور کلی به دو دسته ۱) فعال(active) و ۲) غیرفعال(passive) تقسیم می گردند. کلیه این روش ها تمرکز بیشتر خود را بر افزایش دقت و سرعت تشخیص بیماری سرطان قرار داده اند. به عبارت دیگر در کلیه روش های ابداعی برای جداسازی سلول های سرطانی، دو پارامتر بسیار مهم می باشند: 1- بازده روش، که عبارتست از تعداد سلول های سرطانی جداشده به کل تعداد سلول های موجود ۲ – سرعت جداسازی، که حداکثر دبی ورودی به میکروکانال را مشخص می نماید که بازده دستگاه کاهش چشمگیری پیدا نکند.

روش های جداسازی سلول های سرطانی در گردش در مقالات را می توان به چهار دسته ی کلی زیر تقسيم نمود :

• جداسازی سلول های سرطانی در حال گردش با استفاده از اختلاف در اندازه، چگالی و شکل پذیری.
• جداسازی با استفاده از دی الكتروفورسیس
• جداسازی سلول های سرطانی با استفاده از موج های آکوستیک
• جداسازی سلول های سرطانی با استفاده از اعمال میدان مغناطیسی

هر یک از این روش ها با ذکر مثال در زیر توضیح داده خواهد شد.

جداسازی با استفاده از دی الکتروفورسیس(Dielectrophoresis یا DEP):

این روش از تفاوت در میزان قطبی شدن سلول های سرطانی و سالم برای جداسازی استفاده می نماید، بدین منظور سیال در یک میدان غیر یکنواخت الکتریکی قرار می گیرد.

شکل جداسازی با استفاده از تفاوت در خواص قطبی شدن ذرات در حضور میدان الکتریکی.

 

به علت تفاوت در میزان قطبی شدن سلول های سالم و سرطانی نیروهای متفاوتی به آنها وارد می گردد که همین موضوع باعث می شود در حضور میدان الکتریکی سلول های سرطانی و سالم در مکان های مختلفی مستقر گردند به طور مثال همان طور که در شکل بالا مشاهده می شود به کلیه سلول ها یک نیروی برآ و یک نیروی ناشی از میدان الکتریکی اعمال می گردد که در این بین به سلول های سرطانی نیروی بیشتری از طرف میدان الکتریکی وارد می شود لذا بیشتر به سمت صفحه پایینی جذب می شوند و در ارتفاع پایینتری نسبت به سلول های سالم قرار می گیرند.

روش بعدی ترکیبی از روش جداسازی با استفاده از تفاوت در اندازه و تفاوت در میزان قطبی شدن در میدان­های الکتریکی می باشد. بدین منظور ابتدا از چند منفذ سيال عبور کرده تا تعدادی از سلول های سرطانی ابتدا جدا گردند سپس با استفاده از میدان الکتریکی سلول های سرطانی باقی مانده و سلول های سالم از دو خروجی مختلف خارج می گردند.

مزیت اصلی روش جداسازی با استفاده از تفاوت در ابعاد، در میزان خروجی یا همان سرعت آزمایش می باشد و مزیت اصلی روش دی الکتروفورس در میزان نسبتا بالای درصد خلوص سلول های جداسازی می­باشد. لذا با این روش از مزیت هر دو روش استفاده می گردد و دستگاه هر دو مزیت خروجی و درصد بالای خلوص را دارا می باشد.

جداسازی سلول های سرطانی با استفاده از موج های آکوستیک:

این روش اخیراً در سال ۲۰۱۴ توسط دانشگاه ایالتی ماساچوست پیشنهاد شده است که زاویه موج آکوستیک اعمال شده بر جریان سیال بهینه سازی شده است و مقدار بهینه آن برای ماکزیمم شدن تعداد سلول های سرطانی جدا شده بدست آمده است در زیر طرحی شماتیک از این روش آمده است.

شکل دستگاه جداسازی سلول های سرطانی با استفاده از موج های آکوستیک.

به هر ذره در این روش دو نیروی درگ و نیروی وارد شده بر سلول ها از طریق موج های آکوستیک اعمال می گردد. در این بین جرم سلول، زاویه خطوط فشاری ناشی از موج های آکوستیک و جریان سیال، میزان موج های آکوستیک و دبی جرمی سیال در میزان جدا سازی سلول ها نقش مهمی ایفا می کنند. در این روش تعداد خطوط فشاری هم برخلاف حالت سنتی آن بیشتر از یکی می باشد تا اگر سلول هدف از یکی از خطوط فشاری فرار کرد در دام خط بعدی بیافتد و به جهت نیرویی که موج فشاری به آن وارد می کند در راستای آن خطوط حرکت کرده که در نتیجه سلول های سرطانی از سلول های عادی که روی خطوط حرکت نمی کنند جدا می شوند. در این روش کلیه پارامترها بهینه شده است که برای زاویه خطوط فشاری مقدار ۳۰ درجه بهينه تشخیص داده شد. در نتیجه سلول های بزرگتر در راستای خطوط فشاری و سلولهای کوچکتر در راستای جریان سیال حرکت می کنند که  سبب جدا سازی سلول ها از هم می شود.

جداسازی با استفاده از اعمال میدان مغناطیسی به سیال :

تا اینجا کلیه روش ها بدون استفاده از پادتن بوده اند حال در این روش باید در صورتی که نوع سرطان مشخص باشد آنتی بادی های سلول سرطانی مورد نظر را به سطح ذرات مغناطیسی متصل کرده و وارد خون گردند تا آنتی بادی ها به سطح آنتی ژن روی سلول سرطانی متصل شوند تا بدین منظور سلول های سرطانی خاصیت مغناطیسی پیدا کرده و در داخل میدان به سمت صفحات مغناطیسی جذب گردند.  در کلیه این روش ها یک مرحله آماده سازی مورد نیاز می باشد. بدین منظور با عبور خون که در آن سلول های سرطانی در حال گردش نشانه گذاری شده اند از یک کانالی که میدان مغناطیسی در راستای کانال ایجاد شده است می گذرند.

شکل جداسازی سلول های سرطانی با استفاده از پادتن

همانطور که مشاهده می شود به سلول های سرطانی که حال خاصیت مغناطیسی دارا می باشند یک نیرویی به سمت صفحه وارد می گردد که اگر این نیرو به اندازه کافی بزرگ باشد سبب می شود سلول های سرطانی جذب صفحه شده و از سلول های خونی سالم که از خروجی خارج می گردند جدا بگردند. اگرچه این روش سبب جداسازی ۸۰ تا ۹۰ درصد سلول های سرطانی میگردد اما احتمال از بین رفتن سلول های سرطانی به علت تنش های وارد شده بر آن ها وجود دارد بدین منظور اینگبر و همکارانش یک روش دیگر برای این جداسازی پیشنهاد دادند که در آن دستگاه شامل یک میکروکانال اصلی و چندین محفظه می باشد که به صورت عمودی به میکروکانال اصلی وصل می گردد.

شکل کاهش تنش با استفاده از ایجاد چندین محفظه.

همانطور که در شکل دیده می شود آهنرباها در کنار محفظه قرار می گیرند تا سلول های سرطانی وادار به ورود به داخل محفظه ها بشوند که در این روش تنش وارد بر سلول های سرطانی که در داخل این محفظه ها به آنها وارد می گردد کمینه شده و سلول ها زنده می مانند. با استفاده از این روش با عبور جریان خون، سلول های سرطانی دارای خاصیت مغناطیسی، داخل محفظه ها به دام افتاده و از خون جدا می شوند.

جداسازی سلول های سرطانی در حال گردش با استفاده از اختلاف در اندازه و شکل پذیری :

سلول های سرطانی به طور معمول از سلول های دیگر خون از جمله گلبول قرمز و گلبول سفید بزرگتر و دارای تنش سطحی بیشتری می باشند، همین تفاوت های فیزیکی به دانشمندان کمک کرده است تا روش­های مختلفی را برای جداسازی سلول های سرطانی در گردش از خون ابداع نمایند.

جداسازی با استفاده از تفاوت در میزان کشش سطحی و اندازه سلول های سرطانی :

در این روش که تصویری شماتیک از آن در شکل زیر نمایش داده شده است، فردی به نام بیل لين به همراه همکاران خود، روشی به منظور جداسازی با بهره بردن از تفاوت در میزان کشش سطحی سلول ها ابداع کردند، در این روش ایتدا همانطور که در شکل زیر دیده می شود، سیال با استفاده از میکروکانال وارد یک منطقه ای میگردد که موانع در آن تعبیه شده اند.

سلول ها قابلیت تغیییر شکل دارند، بنابراین در صورتی که نیروی لازم به آنها اعمال گردد قادر خواهند بود از بین این موانع عبور کنند. میزان نیروی لازم برای عبور سلول از بین موانع به میزان تنش سطحی آن وابسته می باشد، در این بین از آنجا که سلول های سرطانی تنش سطحی بیشتری دارا می باشند، میزان فشار بیشتری نیاز دارند تا از موانع عبور نمایند. لذا اگر میزان اختلاف فشار اعمالی بین دو نقطه V5 بالایی و پایینی را به میزانی انتخاب گردد که سلول های سرطانی قادر به عبور از موانع نباشند و سلول های دیگر قادر باشند، عملا سلول های سرطانی را در بین یکی از این ردیف های موانع به دام انداخته و جدا می شوند.

شکل جداسازی با استفاده از تفاوت در میزان کشش سطحی.

 

میکروکانال هایی دارای انبساط ناگهانی در سطح مقطع :

این روش توسط شونگ پارک و همکاران در سال ۲۰۰۹ پیشنهاد داده شد. در زیر تصویری شماتیک از این روش را مشاهده می نمایید.

شکل میکروکانال های دارای انبساط های ناگهانی.

 

در این روش سیال وارد یک میکرو کانال میگردد، که در این میکرو کانال با فاصله های مشخصی سطح مقطع میکروکانال بصورت ناگهانی بزرگتر می گردد. همانطور که در شکل بالا دیده می شود، خطوط جریان سیال یا همان خون در این حالت تغییر کرده و به شکل بالا در می آیند. در این حالت اگر ذره به طور کامل از خطوط جریان پیروی نماید، در داخل بخش انبساط یافته میکرو کانال به دام افتاده و به دور خود می گردد، ولی اگر از خطوط جریان پیروی ننماید، به مسیر خود ادامه داده و به داخل بخش انبساط یافته ورود نمی کند. در اینجا عددی به نام استوکس تعریف می گردد که ذرات با استوکس بالاتر از خطوط جریان پیروی نمی کنند و به مسیر خود ادامه می دهند. سلول های سرطانی هم عدد استوکس بالایی در داخل خون دارا می باشند، به عبارت دیگر سلول های سرطانی به دلیل ابعاد بزرگتر، بسیار لخت تر از سلول های دیگر خون می باشند، بنابراین جریان سیال توانایی هدایت آنها به بخش انبساطی را دارا نمی باشد. در نتیجه گلبول های قرمز و سفید در این روش در داخل میکرو کانال به دام افتاده و سلول های سرطانی از خروجی میکروکانال خارج می گردند و از سایر ذرات داخل خون جدا می گردند.

جداسازی با استفاده از میکروکانال مارپیچ :

در این روش همانطور که در شکل زیر مشاهده می شود، سیال از داخل یک میکروکانال مارپیچ عبور

داده می شود.

شکل میکروکانال مارپیچ.

سیال در این روش وارد یک میکرو کانال مارپیچ شده و از دو خروجی متفاوت از سمت دیواره داخلی میکرو کانال و دیواره خارجی خارج می­گردد. این روش به تازگی برای اولین بار در سال ۲۰۰۸ توسط كنتاگوداناهیل و همکارانش که ارائه گردید.

سلول های سرطانی در گردش(CTC):

سلول های سرطانی در گردش سلول هایی هستند که از تومور اصلی نشئت گرفته و توسط عروق خون یا لنف در بدن پراکنده می شوند. این سلول ها با رسیدن به موقعیت جدید مناسب، توانایی ایجاد تومورهای جدید با خواصی مشابه یا متفاوت با تومور اولیه را دارند. تشخیص و جداسازی این سلول ها از خون، امکان شمارش و مطالعه بر روی CTC ها را فراهم می کند. میزان شیوع سرطان در بدن و درصد پیشرفت آن با بررسی CTC ها امکان پذیر است. به علاوه با بررسی ژنتیک CTC ها و اثر سنجی داروهای مختلف روی آنها، تشخیص روش های درمانی مناسب برای از بین بردن این سلول ها عملی می شود. جداسازی CTC ها از خون از پنجاه سال پیش مورد اهمیت قرار گرفته است و روش های بسیاری برای این امر معرفی شده است. میکروفلوئیدیک به عنوان ابزاری دقیق و مناسب برای جداسازی CTCها از سایر سلول های خون در دو دهة اخیر مورد توجه قرار گرفته است.

میکروفلوئیدیک، مینیاتوری­کردن روش های مرسوم سیالاتی است. در این حیطه، دستگاه های طراحی شده دارای ابعاد میکرونی هستند. میکروفلوئیدیک با داشتن ویژگی های مطلوبی از جمله ارزان قیمت بودن، نیاز به مقادیر کم نمونه، قابلیت جابه جایی، دقت بالا و توانایی ادغام چندین فن آوری ابزار بسیار مناسبی برای جداسازی سلول ها است. علت اصلی درصد بالایی از مرگ های ناشی از سرطان، فرآیند متاستاز است. فرآیندی چندمرحله ای که طی آن سرطان در بدن بیمار پخش می­شود و قسمت های مختلف بدن را درگیر می­کند. این پدیده اولین بار در سال 1869 توسط توماس آشورث با مشاهدة سلول های سرطانی در رگ پای بیمار و جایی دور از تومور اصلی گزارش شد. این سلول ها امروزه به عنوان سلول های سرطانی در گردش(CTC) نامیده شده و سلول هایی هستند که از تومور اولیه نشئت گرفته و در جریان خون و لنف بیمار به گردش در می آیند. CTCها در شروع فرآیند متاستاز نقش اصلی را ایفا می­کنند. برای پخش شدن سرطان در بدن، سلول ها باید از تومور اصلی جداشده و توسط خون یا لنف به دیگر نقاط بدن حمل شوند. در جریان گردش در خون، سلول های سرطانی با موانع زیادی از جمله مقابله سیستم ایمنی و مرگ سلولی برنامه ریزی شده(آپپتوز) یا مرگ در اثر جداشدن از ماتریس خارج سلولی (ECM) (آنويكيز) روبرو می­شوند. از طرفی همه سلول های باقیمانده قادر به خروج از جریان خون و مستقرشدن در مکان جدید نیستند. تعداد بسیار کمی از سلول­هایی که درنهایت زنده باقی می مانند، قادر به تکثیر هستند. سلول هایی که از مجموعه این مراحل به موفقیت عبور کرده اند، توانایی ایجاد تومور جدید و انجام فرآیند متاستاز در بدن بیمار را دارند. درنتیجه مطالعه و بررسی این سلول ها، که مهمترین تهدید برای بیماران سرطانی محسوب می شوند، بسیار حائز اهمیت است.

CTCها خواص بیوشیمیایی و فیزیکی متفاوتی با سلول های خون دارند. اغلب CTCها دارای پروتئین­های سطحی متفاوتی با سلول های خونی هستند و از نظر اندازه نیز بزرگتر از سلول های خون می باشند. درحالیکه پلاکت های خون حدود 5 میکرومتر، گلبول های قرمز حدود 8 میکرومتر و گلبول های سفید اندازه­ای بین 10 تا 15 میکرومتر دارند، متوسط اندازه CTCها خواص بیوشیمیایی و فیزیکی متفاوتی با سلول های خون دارند. متوسط اندازه CTCها 15 تا 25 میکرومتر است.

اهمیت بالینی CTCها:

مطالعه هویت و موقعیت CTCها در بیماران سرطانی اهمیت بالایی دارد. حضور CTCها در جریان خون، امکان مطالعه و بررسی آنها با نمونه های آزمایش ساده خون را می دهد. این روش برخلاف نمونه برداری از تومور که در پزشکی سرطان رایج است، برای پزشک و بیمار بسیار آسان بوده و امکان تکرار روش نیز وجود دارد. به علاوه سلول های سرطانی موجود در نمونه خون آنهایی هستند که موانع ذکر شده را با موفقیت طی کرده و توانایی ایجاد متاستاز رادارند. تحقیقات متعددی کارایی روش های مبتنی بر تفکیک CTC را به نسبت دیگر روش های مرسوم در پیش بینی پیشرفت بیماری، تشخیص اثربخشی درمان، طبقه بندی بیماران و ارائه درمان های منحصر به فرد نشان داده است.

روش های شناسایی CTCها:

 CTCها سلول هایی با خواص گوناگون از هم و سایر سلول ها هستند. شناسایی آنها به روش های مختلفی انجام می پذیرد. رایجترین روش شناسایی آن ها به کمک روش های ایمونوهیستوشیمی است. این روش برای CTCها به صورت مثبت و منفی انجام می شود.

رنگ آمیزی با علامت گذاری مثبت که در آن تنها سلول های هدف از بین جمعیت سلولی رنگ آمیزی می­شوند، با روش های رنگ آمیزی با سایتوکراتین و DAPI و رنگ آمیزی با علامت گذاری منفی که در آن همه سلول ها به جز سلول های مطلوب رنگ می گیرند، با آنتی بادی CD45 انجام می شود. این روش می­تواند به دلیل غیریکنواختی CTCها یا پنهان شدن آنها در بین سلول های سالم دارای خطاهایی باشد. از طرفیCTCها ممکن است تحت گذار سلول های اپیتلیال به سلول های مزانشیمی(EMT) قرار بگیرند.

فرآیندی که در آن سلول های اپیتلیال به سلول های بنیادی مزانشیمی تبدیل می شوند. این فرآیند در حالت عادی مفید بوده و می تواند باعث ترمیم بافت های آسیب دیده شود ولی در مورد سلول های سرطانی، امکان ایجاد انواع مختلفی از سلول های سرطانی را ایجاد می کند. مراحل طی شده توسط سلول در فرآیند EMT ممکن است در شکل زیر قابل مشاهده است.

شکل چرخه EMT در این تصویر مراحل تبدیل سلول های سرطانی اپی تلیال به سلول های بنیادی سرطان و جابجایی آن ها در خون از چپ به راست آورده شده اند.

 

قرارگرفتن سلول ها در این فرآیند، بیان شاخصه های اپیتلیال مانند سایتوکراتين يا EpCAM را مهارکرده و باعث بیان شاخصه های سلول ها مزانشیمی مانند ویمنتین می شود. درنتیجه روش­های تشخیصی ایمونوهیستوشیمی به تنهایی قادر به شناسایی و تفکیک کلیدی CTC ها نخواهند بود. روش دیگر در تفکیک CTCها، جداسازی به کمک اندازه است. CTCها عموماً از دیگر سلول­های خون درشت تر بوده و بر این مبنا جداسازی آنها از طریق فیلتراسیون صورت می گیرد. اما یافته های جدید حاکی از آن است که CTCها از نظر اندازه نیز بسیار غیریکنواخت هستند. به طوری که وجود CTCهایی با ابعاد کمتر از 4 میکرومتر و بیشتر از 30 میکرومتر گزارش شده است. روش های مختلفی برای شناسایی و تفکیک CTCها طراحی شده و استفاده می شود. مطالعات زیادی نیز برای بهبود این روش ها و ابداع روش های جدید در حال انجام است. باتوجه به قابلیت ها و محدودیت های موجود در هر روش، روش جداسازی انتخاب میگردد.

میکروفلوییدیک(Microfluidics):

میکروفلوئیدیک، علم و فناوری بررسی دستگاه هایی که قابلیت کارکردن با سیالات در اندازه­های بسیار کوچک (^8- 10- ^9- 10 لیتر) را دارند است. در این فناوری از کانال­هایی با ابعاد ده ها تا صدها میکرومتر استفاده می شود. میکروفلوئیدیک در علوم مختلف، از سنتزهای شیمیایی و آنالیزهای زیستی، تا اپتیک و فناوری اطلاعات کاربردهای فراوانی دارد. میکروفلوئیدیک نخستین بار به دلیل ویژگی های منحصر به فرد آن در آنالیزهای آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گرفت. این ویژگی­های منحصر به فرد عبارت اند از امکان انجام سنجش با مقادیر کم نمونه و معرفی انجام جداسازیها با دقت و حساسیت بالا، قیمت پایین و زمان کم انجام سنجش پیدایش و پیشرفت میکروفلوئیدیک چهار منبع اصلی دارد که عبارت اند از آنالیز مولکولی، دفاع زیستی، زیست شناسی مولکولی، و میکروالکترونیک.

آنالیز مولکولی:

اولین زمینة ابداع میکروفلوییدیک برای استفاده در سنجش بوده است. ساخت دستگاه هایی مانند کروماتوگرافی فاز گازی(GPC)، کروماتوگرافی فشار بالای مایع (HPLC) و الکتروفورز در لوله های موئين (CE) باعث انقلابی در زمینة شیمی تجزیه شده اند. تلفیق این روش ها با فناوری لیزر، امکان دستیابی به دقت و حساسیت بالا، در کنار استفاده از مقادیر ناچیز نمونه را عملی می سازد. با موفقیت این روش ها، توسعه نمونه های جدید، فشرده تر و چندجانبه تر دستگاه های میکروفلوییدیک و جستجو برای کارایی های جدید در زمینه ی شیمی و بیوشیمی، طبیعی به نظر می رسد.

دفاع زیستی:

دومین انگیزه پیشرفت میکروفلوییدیک پس از پایان جنگ سرد که سلاح های شیمیایی و زیستی موجب صدمات وحشتناکی شدند، ایجاد شد. برای مقابله با عواقب آن، آژانس پروژه های تحقیقاتی پیشرفته دفاعی وزارت دفاع آمریکا(DARPA) در دهه 90، برنامه هایی برای حمایت از پروژه هایی برای پیشرفت و گسترش دستگاه های میکروفلوییدیک که برای شناسایی تهدیدهای شیمیایی – زیستی طراحی می شدند، تدوین کرد. این برنامه ها از جمله مهم ترین دلیل پیشرفت سریع میکروفلوئیدیک بود.

زیست شناسی مولکولی:

سومین عامل پیشرفت میکروفلوئیدیک از پیشرفت زیست شناسی مولکولی نشئت گرفته است. رونق علم ژنومیک در دهه 80، که با ظهور زمینه های دیگری از سنجش های زیستی در ابعاد میکرو مانند تعیین توالی DNA با بازدهی بالا رخ داد، نیازمند روش های اندازه گیری با دقت و حساسیت و بازدهی بالاتر بودند. میکروفلوئیدیک راه کارهای جدیدتری برای غلبه بر این مشکلات ارائه داد.

میکروالکترونیک:

یکی دیگر از عوامل پیشرفت میکروفلوئیدیک، علم میکروالکترونیک بود. هدف میکروفلوئیدیک، ابتدا الهام­گرفتن از فوتولیتوگرافی و فناوری های مرتبط که در زمینه ی میکروالکترونیک و دستگاه های میکروالکترومکانیکی(MEMS) بود. اما به تدریج به دلیل استفاده های زیستی از میکروفلوییدیک، استفاده از پلیمرها که عبور دهی نور، انعطاف پذیری و قابلیت نفوذ بیشتری برای گازها داشتند، جایگزین مواد سخت مصرفی در میکروالکترونیک، مانند شیشه و سیلیکون شد.

زمینه های کاربرد میکروفلوئیدیک:

یکی از پیشرفته ترین کاربردهای میکروفلوییدیک در حال حاضر، بررسی و کنترل شرایطی مثل pH، قدرت یونی و غلظت در فرآیند بلوره کردن پروتئین ها است. از کاربردهای دیگر میکروفلوییدیک می توان به جداسازی، صنایع دارویی، سنجش های زیستی، بررسی نمونه های تک سلول یا تک مولکول و سنتز مواد آلی اشاره کرد. یکی دیگر از قابلیت های مهم میکروفلوییدیک، توانایی کار کردن با سیالات چند فازی است.

میکروفلوییدیک، قابلیت توزیع یکنواخت حباب ، یا قطرات فاز مایع یا گاز پراکنده، در جریان پیوسته ی مایع را می دهد. این فرآیند، افق های جدیدی در تولید ذرات پلیمری، امولسیون و فوم را رونمایی می کند. میکروفلوئیدیک در زمینه زیست شناسی سلولی نیز حائز اهمیت است. سلول های یوکاریوت، وقتی به سطح می چسبند و تکثیر می شوند، اندازه های خطی میکرومتر 100-10 دارند. این ابعاد، کاملاً با میکروکانال­های ساخته شده همخوانی دارد. استفاده از میکروفلوئیدیک در میکرو دستگاه های مورد استفاده برای سنجشهای زیستی نیز به سرعت رو به افزایش است. از مهم ترین شاخه های استفاده از میکروفلوییدیک می توان به استفاده از آن در زمینه تفکیک و دسته بندی سلول ها اشاره کرد.

فناوری های شکل گرفته براساس میکروفلوئیدیک:

میکروفلوییدیک در زمینه های بسیاری کاربرد دارد. تحقیقات در زمینه سلول های بنیادی، از فناوری میکروفلوئیدیک بهره می برد. سنجش سلول های بنیادی در یک تراشه ی میکروفلوییدیک بسیار دقیقتر از ظرف های کشت مرسوم انجام پذیر است. مینیاتوری­کردن سنجش، بازدهی کل کار را بالا می برد چرا که امکان کنترل سیال و شبیه سازی دقیق بیولوژیکی برای کار کردن با سلول های بنیادی در دستگاه های میکروفلوییدیک مقدور می شود. استفاده از میکروفلوییدیک برای کشت سلول، در مهندسی محیط کشت باعث کاهش مقدار مواد مصرفی، افزایش بازدهی، بهبود کنترل شرایط دما و بهبود ارتباط فیزیولوژیک و پاتوفیزیولوژیک سلول های کشت داده می شوند. از طرفی امکان کشت سه بعدی و کشت هم زمان چند گونه سلول این فناوری را برای کشت سلولی منحصر به فرد می کند.

از جمله سلول هایی که کشت آنها در تراشه ها میکروفلوییدیک مورد توجه قرار گرفته است، سلول های عصبی می باشند. کشت این سلول ها به دلیل حساسیت بالای آنها، نیاز به کنترل ساختار شیمیایی محیط کشت و لزوم هدایت هندسی آنها است. به تازگی با استفاده از دستگاه های میکروفلوئیدیک، امکان کشت مدلهای پیچیده و چندگانه با قابلیت ایجاد یک عضو در بدن نیز ایجادشده است. مفهوم عضو بدن بر روی تراشه را می توان کشت سلولی برای ایجاد اعضا و بافت ها در سه بعد در ابعاد کوچک و در محیط آزمایشگاه تعریف کرد که تا حد قابل قبولی، مشخصات و ویژگی های همان عضو اصلی را در بدن شبیه سازی می کنند. این اعضا از انواع مختلفی از سلول که مجاور هم که در یک تراشه در مجاورت هم قرار داده شده و بر هم اثر متقابل دارند، تشکیل می شوند. تلفیق این فناوری با استفاده از مفهوم سلول های القایی پرتوان، که امکان تمایز به انواع مختلف سلول ها را دارند، امکان ساخت اعضای بدن سالم و ایجاد بیماری های مختلف بر روی آنها در آزمایشگاه را میسر می سازد. به کمک این تراشه ها، کنترل روند پیشرفت بیماری ها، بررسی سمیت داروها، نظارت بر دارورسانی هدفمند در آزمایشگاه و بدون نیاز به نمونه های حیوانی عملی می شود.

از نمونه های اعضای بدن بر روی تراشه که تاکنون ساخته شده اند، می توان به کلیه بر روی تراشه، شبیه­سازی بیماری های کبد بر روی تراشه و بررسی سیستم عصبی مرکزی و بیماری های آن بر روی تراشه اشاره کرد. دستگاه های دارورسانی، تأثیر عمده ای بر فناوری پزشکی گذاشته اند و اثربخشی بسیاری از داروهای موجود در حال حاضر را بهبود بخشیده اند. تبدیل دستگاه های دارورسانی متداول به دستگاه های دارورسانی در ابعاد میکرو و نانو امکان به کارگذاشتن این دستگاه ها در بدن را میسر می­سازد که به کمک آنها می توان وضعیت سلامتی بیمار را کنترل و درمان های پیشگیری کننده از عود بیماری را از خارج بدن طراحی کرده و به بدن اعمال کرد. این دستگاه­ها می­توانند داروها را با دوزهای مختلف به صورت پیوسته یا منقطع و در بازه های زمانی طراحی شده به بدن وارد کنند. درحالیکه در دستگاه های دارورسانی متداول مصرف دارو، دارو ممکن است در دوزهای بالاتر یا پایین تر از حد موردنیاز یا با نرخ نامناسب وارد بدن شده و ایجاد سمیت کند یا اثربخشی ناچیزی داشته باشد. این سامانه برای بیماری ها و درمان های مختلف و به روش های مختلف قابلیت کارگذاری در بدن را دارند. دستگاه هایی در ابعاد کوچکتر از 100 میکرومتر از طریق تنفس، کمتر از 200 میکرومتر از طریق تزریق به بافت و کمتر از 1 میلیمتر از طریق بلع وارد بدن می­شوند. دستگاه های دارورسانی در ابعاد بزرگتر نیز از طریق پچ های کار گذاشته شده روی سطح پوست قابلیت انتقال دارو را دارند.

پچ های روده ای بلعیدنی برای دارورسانی پروتئین ها، پچ های کاشتنی برای مهار تومورهای سرطانی و دستگاه های دارورسانی پوستی انسولین از طریق میکرو سوزن ها از موفق ترین دستگاه های دارورسانی با استفاده از میکروفلوییدیک بوده اند. از مهمترین شاخه های استفاده از میکروفلوئیدیک می توان به استفاده از آن در زمینه ی تفکیک و دسته بندی سلول ها اشاره کرد.

استفاده از تراشه های میکروفلوییدیک برای دسته بندی سلول ها:

سلول ها، به ویژه سلول های جانوری از نظر ژنتیک، پروتئومیک، و شاخصه های رفتاری رفتار بسیار متفاوتی با یکدیگر نشان می دهند. برای تفکیک آنها از هم، از روش هایی مانند PCR استفاده می شود. بسیاری از تحقیقات بیوشیمیایی، علوم دارویی، و کلینیکی، نیازمند کار با نمونه هایی متشکل از تعداد بسیار زیادی سلول هستند. برای دستیابی به نتایج دقیق تر این مطالعات نیازمند دسته بندی سلولها به رده هایی با ویژگی های مشابه برای انجام مطالعات روی آنها هستند. تشخیص های کلینیکی، مطالعات ژنومیک و پروتئومیک و تحقیقات بر روی سلول های بنیادی، از جمله زمینه های تحقیقاتی هستند که تفکیک و رده­بندی سلول ها برایشان بسیار با اهمیت است. فناوری آزمایشگاه بر روی تراشه به دلیل ویژگی های منحصر به فرد آن اخیرا در جداسازی سلول ها مورد استفاده قرار گرفته است.

انواع جداسازی سلولی:

جداسازی و دسته بندی سلول ها به دو طریق صورت می­گیرد: دسته بندی به توده های سلولی و دسته­بندی تک سلول ها. در تفکیک به توده های سلولی، سلول ها به صورت توده هایی با ویژگی های مشترک دسته­بندی می شوند. در حالی که در دسته بندی تک سلول ها، هر سلول به طور منفرد انتخاب شده و بررسی می شود. راهکارهای متداول مورداستفاده در دسته بندی توده ای سلول ها عبارت اند از، سانتریفیوژ (جداسازی بر اساس اندازه و چگالی) و گیر انداختن به وسیله اتصال آنتی بادی به سطح سلول(جداسازی براساس حضور آنتی ژن خاص روی سطح سلول).

دسته بندی توده ای سلول، متمرکز بر ایجاد نمونه ای غنی از سلول های هدف است و هدف آن تهیه جمعیت یکنواختی از سلول ها نیست. روش متداول در دسته بندی تک سلول ها، استفاده از یاخته سنجی جریان است. جداسازی با استفاده از جریان سیال، باوجود اینکه نیازمند هدایت سلول ها به دو یا تعداد بیشتری گروه برای رسیدن به خلوص مطلوب است، نسبت به سایر روش های مرسوم، خالص ترین نمونه ها را می دهد. تمامی روش های متداول، نیازمند حجم زیاد نمونه ی اولیه، که سلول ها در محلولی برای انتخاب و دسته بندی معلق شده اند، می باشند. به این دلیل که اغلب سلول ها به صورت چسبیده به سطح یا به یکدیگر رشد می کنند. در نتیجه مطالعه و بررسی آن ها در حالت طبیعی خودشان، مطلوب تر از کندن سلول ها از سطح و شناورسازی آنها در محلول است. جداسازی به وسیله ی تفکیک به حلقه های همانندساز و تقسیم به قطعات ریز به کمک لیزر، این هدف را عملی می سازد. اما بازدهی کار بسیار پایین بوده و نرخ مرگ سلولی بسیار بالاست. برای تفکیک سلول ها با روش های مرسوم، پیش بینی های احتیاطی وجود دارد. از جمله مهم ترین آنها، قرار گرفتن افراد در معرض عوامل خطرزا و آلوده است. تفکیک به وسیله ی ایجاد قطره، تحولی در فناوری های مربوط به جداسازی سلول با سرعت های بسیار بالا را فراهم کرد. محدودیتهای ذکر شده در روش های متداول تفکیک سلول، انگیزه ی پیشرفت روش های میکروفلوییدیک برای تفکیک سلولها است.

مراحل دسته بندی و تفکیک سلول ها:

شناسایی:

قدم اول در هر دسته بندی، چه در روش های سنتی و چه در فناوری های نو مانند آزمایشگاه بر روی تراشه، غربال کردن سلول ها بر اساس یک یا چند شاخصه که پایه و اساس دسته بندی می باشد، است. سلول ها را می توان براساس ویژگی های فیزیکی مانند اندازه، چگالی، یا رفتار در میدان های نیرو از جمله میدان های الکتریکی یا مغناطیسی و یا براساس مقاومت در برابر تجزیه شیمیایی تفکیک کرد.

ظهور فناوری برچسب گذاری نوری، به ویژه به کمک فلورسانت که با روش یاخته سنجی جریان ادغام شده است، دستاورد مهمی برای رده بندی سلولی تلقی می­شود. همچنین اگر از مواد غیرسمی برای سلول در برچسب گذاری استفاده شود، سلول­ها به طور زنده برای مطالعات و آزمایش های بعدی قابل استفاده خواهند بود. استفاده از آنتی بادی های ادغام شده با ذرات فلوئورسنت یا مغناطیسی، تنوع شاخصه هایی که می توان براساس آنها دسته بندی را انجام داد، افزایش داده اند.

جداسازی:

بعد از این که سلول های هدف شناسایی شدند، باید از سایر سلول های موجود در نمونه جدا شوند. در برخی نمونه ها، شناسایی و جداسازی به طور همزمان قابل پیاده سازی است. مانند جداسازی براساس خواص فیزیکی یا با استفاده از آنتی بادی در دسته بندی تک سلول ها، حضور برچسب های فلوئورسنت برای هر سلول به طور جداگانه بررسی می­شود و سپس براساس ویژگی ها طبقه بندی می شود. دسته بندی می تواند به صورت مثبت یا منفی صورت بگیرد. در دسته بندی مثبت، سلول هدف بر اساس ویژگی های مطلوب، جداسازی شده و برای کاربردهای بعدی جمع آوری می شوند. دسته بندی مثبت معمولا در جداسازی به کمک یاخته سنجی جریان کارایی دارد.

در دسته بندی منفی، سلول های نامطلوب، دارای شاخصه هایی می باشند و براساس این شاخصه ها جذب و جمع آوری می شوند. درنتیجه سلول های هدف، عبور کرده و بدون جذب خارج می شوند. دسته بندی منفی، معمولا در روش­های بر مبنای اتصال مثل اتصال به آنتی بادی، که در آن جداسازی سلول از شناساگر مشکل است، استفاده می شود.

جمع آوری:

هنگامی که سلول ها دسته بندی شده اند، باید برای استفاده های بعدی جمع آوری شوند. همانطور که قبل تر اشاره شد، در دسته بندی توده های سلولی، معمولاً از روش دسته بندی منفی، بر اساس تفاوت در یک شاخصه استفاده می کنند. به عنوان مثال جداسازی بر اساس حضور یا عدم حضور یک لیگاند خاص بر سطح سلول انجام می شود. سلول ها در توده های غنی از سلول های هدف که حاوی سلول های ناخواسته ای از که از مراحل جداسازی فرار کرده اند هستند، جمع آوری می شوند.

دسته بندی مثبت تک سلول ها به وسیلهی یاخته سنجی جریان، می تواند جداسازی سلولی را با خلوص بالایی انجام دهد، اما نیازمند این است که هر سلول به طور دقيق قبل از اعمال جداسازی، بررسی گردد و مناسب ترین روش انتخاب شود. این روش بازده و عملکرد مناسبی دارد و تا زمانی که جمعیت سلولی هدف به سلول های نامطلوب آلوده نشده باشد، سلول ها را با خلوص بالا تفکیک می کند. آلوده شدن جمعیت هدف به سلول های نامطلوب، به ویژه هنگامی که سلولهای مطلوب در اقلیت باشند، شایع است. معمولا در تفکیک تک سلول ها، سلول های تفکیک شده در حین مرحله ی جمع آوری، جداشده و به محفظه ی جداگانه ای منتقل می شوند.

راهکارهای بسیاری برای جداسازی سلولها بر مبنای میکروفلوییدیک ابداع شده است. روش مورد استفاده در این پروژه، جداسازی سلول ها با استفاده از میکروفلوییدیک اینرسی است. در ادامه، معرفی انواع روش های میکروفلوییدیک برای جداسازی سلولها با تأكيد بر روش میکروفلوییدیک اینرسی، بررسی فیزیک مسئله و بیان پارامترهای حاکم در جداسازی با میکروفلوییدیک اینرسی آورده شده است.

روش های میکروفلوییدیک جداسازی:

دستگاه های میکروفلوییدیک براساس نیروی حاکم بر دستگاه به دو دسته تقسیم می شوند. دستگاه های فعال و دستگاه های غیرفعال. دستگاه های فعال جداسازی مانند جداسازی به کمک میدان الکتریکی (الکتروفورز)، جداسازی به کمک میدان مغناطیسی(مگنتوفورز) و جداسازی به کمک امواج مافوق صوت (آکوستوفورز)، دستگاه هایی هستند که جداسازی را به کمک میدان خارجی اعمال شده بر سیستم انجام می دهند. دستگاه های غیرفعال دستگاه هایی هستند که وابسته به هندسه کانال و نیروهای هیدرودینامیکی حاکم بر جریان سیال می باشند. از نمونه دستگاه های منفعل می توان به روش جداسازی جریان گلوگاهی (PFF)، روش جابه جایی جانبی قطعی(DLD) و میکروفلوییدیک اینرسی اشاره کرد. دستگاه های فعال معمولا جداسازی را با بازدهی بالایی انجام می دهند. چون تغییرات شدت میدان خارجی با زمان تنظیم پذیر است. اما برای سرعت سیال محدودیت هایی دارند. زیرا میدان خارجی باید بر كشش هیدرودینامیکی سیال غلبه کند. در مقابل، دستگاه های غیرفعال، بازده کمتری در جداسازی دارند اما طراحی آنها بسیار ساده بوده و توانایی کار کردن با شدت جریان های بالاتر را دارند. در بین انواع مختلف میکروفلوییدیک غیرفعال، میکروفلوئیدیک اینرسی به دلیل کنترل دقیق، ساختار ساده و بازدهی بالا، توجه بسیاری را به سمت خود معطوف کرده است. در شیوه های رایج میکروفلوئیدیک، سیال در رژیم جریانی استوکس قرار دارد. در این رژیم جریانی عدد بی بعد رینولدز معادله زیر، که نسبت نیروهای اینرسی به نیروهای ویسکوز است، بسیار کوچک تر از یک است. درنتیجه نیروهای اینرسی وارد بر سیال قابل چشم پوشی است.

در معادله فوق، ρ و μ به ترتیب چگالی و ویسکوزیته ی سیال در دمای عملیاتی، U سرعت حرکت سیال در کانال و D قطر کانال می باشند.

میکروفلوییدیک اینرسی در Reهای متوسط (1000>Re>1( و در ناحیه بین رژیم های استوکس و درهم تعریف می شود. در این ناحیه، نیروهای ویسکوز و اینرسی محدود بوده و هر دو بر رفتار سیال تأثیر گذار هستند. برای میکروفلوییدیک اینرسی در یک کانال خمیده یا در یک کانال مسطح که دارای انبساط و انقباض می باشد که سیستم مورد بحث ما است دو مفهوم اساسی تعریف می شود. تغییر مکان اینرسی و جریان ثانویه تغییر مکان اینرسی پدیده ای است که در آن ذراتی که به طور اتفاقی پراکنده شده اند، در ورودی یک کانال مستقیم، در جهت عرضی جابه جا شده و پس از طی مسافت مشخصی در موقعیت های تعادلی قرار می گیرند. پدیده تغییر مکان اینرسی، ناشی از برهم کنش دو نیرو است. نیروی اول، نیروی بالابر برشی، ناشی از انحنای پروفایل سرعت سیال است و تحت تأثیر آن ذره از مرکز کانال دور می شود، و نیروی دوم، نیروی بالابر دیواره کانال است این نیرو در نتیجه ی تأثیر میدان جریان بین ذرات معلق و دیوارهی کانال نزدیک به آنها ایجاد می شود و تحت تأثیر آن، ذره از دیواره دور می شود. موقعیت تعادلی ذرات، از موازنه بین دو نیروی مذکور ناشی می شود.

جریان ثانویه معمولا در کانال های خمیده یا کانال های مسطحی که دارای تغییرات متعدد عرض كانال هستند ایجاد می شود. در یک کانال خمیده، جریان ثانویه، به واسطه ی وجود تغییرات فشار در جهت شعاعی ناشی از عدم مطابقت تكانه سیال در مرکز و در مجاورت دیواره در یک انحنا ایجاد می شود. در سطح مقطع كانال، المانهای سیال نزدیک به مرکز کانال، تکانهی بیشتری از المان های مجاور دیواره تحمل می­کنند. درنتیجه جریانی از مرکز به سمت خارج (به سمت دیواره ها) ایجاد می کنند و موجب حرکت المان­های سیال ثابت نزدیک دیواره به سمت مرکز می شوند. درنتیجه دو جریان چرخشی غیر هم جهت ایجاد می شوند که گرداب های دین نامیده می شوند. گرداب های دین می توانند موقعیت تعادلی اینرسی را با اعمال نیروهای کششی ویسکوز بر ذرات عمود بر جریان اصلی، تعدیل کنند. جداسازی ذرات بر اساس اندازه آنها با استفاده از تفاوت نسبت نیروهای بالابر اینرسی به نیروی کشش جریان ثانویه، امکان پذیر خواهد بود. به علاوه، گرداب های دین(Dean vortex)، طول مورد نیاز کانال برای جداسازی را به واسطه ی آثار جريان ثانویه کاهش داده و به ذرات کمک می کنند سریع تر به موقعیت تعادلی برسند.

دستگاه های میکروفلوئیدیکی جداسازی سلول ها:

دستگاه های فعال تفکیک سلول ها:

در سیستم های جداسازی فعال، از اعمال نیروهای خارجی از قبیل نیروهای الکتریکی یا میدان مغناطیسی یا صوتی برای هدایت و کنترل سلول ها استفاده می شود. این دستگاه ها، توانایی کنترل دقیق و سرعت عمل نسبتا بالایی دارند.

جداسازی به شیوه الکتروفورز و دی الکتروفورز:

جداسازی با کمک میدان الکتریکی به دو شیوه الکتروفورز و دی الکتروفورز انجام پذیر است. الکتروفورز، جابجایی ذرات، ناشی از اثر میدان الکتریکی بر مقدار خالص بار آزاد آنها است. درنتیجه این روش مبتنی بر خواص سطحی غشاء سلول است. این روش برای جداسازی ویروس ها، باکتری ها از سلول های یوکاریوت به کار رفته است اما بار خالص سطحی معیار مناسبی برای تفکیک ملقمه ای از سلول ها با خواص نسبتا مشابه نیست. در نتیجه روش دی الکتروفورز ابداع شده است که علاوه بر خواص غشاء، خواص سیتوپلاسم هم در آنها تاثیرگذار است. دی الکتروفورز، شیوه ی جداسازی مبتنی بر تفاوت در قطبیت پذیری و اندازه ذرات است. وقتی میدان الکتریکی بر ذرات اعمال می شود، ذرات قطبی می شوند. بین این قطبیت القایی، و میدان اعمال شده فعل و انفعالاتی صورت می گیرد که باعث می شود خالص نیروی الکتریکی وارد بر هر ذره، منحصر به خود آن ذره باشد. بزرگی این نیروی خالص، وابسته به خواص دی الکتریکی ذرات (اندازه ذرات و قطبیت پذیری آنها در معرض جریان)، فرکانس و شدت میدان الکتریکی و خواص الکتریکی سیال است

جریان الکتریکی در روش الکتروفورز، می تواند به صورت مداوم یا منقطع بر دستگاه اعمال شود. در آزمایشگاه بر روی تراشه، جریان متناوب مطلوب تر است. برای این منظور از آرایش مختلف الكترودها استفاده می شود.به عنوان مثال، برای اینکه الکترودها مانع عبور جریان نشوند، آنها را به صورت زاویه دار و در آرایش های مختلف همگرا و واگرا قرار می دهند.

در جداسازی CTCها به روش الکتروفورز، با توجه به خواص متفاوت از جمله اندازه سلول های سرطانی و خواص دی الکتریک آنها با بقیه می سلول های خون، جداسازی انجام می شود. معمولاً، CTC ها جذب الكترود شده و به آن می چسبند و بقیه سلول های خون همراه با جریان به حرکت خود ادامه می دهند تا از دستگاه خارج شوند. مزیت این روش نسبت به برخی روش ها این است که می توان سلول ها را بدون اینکه طی فرآیند جداسازی آسیب ببینند، تفکیک کرد. همچنین، این روش، بدون نیاز به برچسب گذاری سلول ها هم انجام پذیر است که هزینه و دردسر کمتری دارد.

در روش دی الکتروفورز، امکان جمع آوری و کشت مجدد سلول ها برای استفاده های بعدی، از جمله تست داروها میسر است. روش اعمال جریان الکتریکی برای آزمودن اثربخشی داروها نیز مورد استفاده قرار گرفته است. به عنوان مثال، برای بررسی میزان دقيق اثربخشی داروی آرسنیک تری اکسید (As₂O₃) که در حال حاضر در درمان سرطان خون مورد استفاده قرار می گیرد، مقادیر مختلف As₂O₃، به دستگاه جداساز دی الکتروفورز فعال(DACS) حاوی سلولهای سرطان خون رده K562 تزریق شده است و با جداسازی سلول­های زنده از بقیه سلول ها، و بررسی نرخ مرگ آنها، تأثیر این دارو بر روی سلول ها مشخص شده است. با این روش، غلظت و بازه های زمانی مناسب برای موثر واقع شدن دارو، مشخص می شود.

معروفترین دستگاه تجاری تفکیک سلولی که از دی الکتروفورز بهره می برد، دستگاه Apo cell است.  این دستگاه برای اولین بار در سال 2009 به بازار عرضه شده است و CTCها را بدون نیاز  به هر گونه برچسب گذاری و بر حسب تفاوت در خواص دی الکتریکی آنها از خون جدا می کند.

شکل دستگاه جداساز دی الکتروفورز، سلول ها توسط پمپ سرنگی به دستگاه تزریق شده و اجازه ته نشینی داده می شود. سپس جریان الکتریکی اعمال می شود. برش مقطعی کانال که در آن نیروهای وارد بر ذره که در نهایت باعث تعیین موقعیت تعادلی آن می شوند، مشخص شده اند.

جداسازی بر مبنای میکروفلوییدیک اینرسی:

دستگاه های میکروفلوییدیک اینرسی ابتدا به منظور متمرکز و مرتب سازی ذرات ابداع شدند. اولین دستگاه در سال 2007 توسط گروه دی کارلو معرفی شد. در این دستگاه که ساختار هندسی مارپیچی داشت، ذرات پراکنده در سیال با آرایش نامنظم و اتفاقی وارد دستگاه شده و به صورت منظم روی یک خط جریان مرتب می شدند. در ادامه ی این پژوهش توسط همین گروه ، وابستگی جداسازی به اندازه ذرات و تراکم ذرات در سیال و اثر عدد رینولدز بررسی شده است. در دستگاه ساخته شده امکان جداسازی ذرات تغییر شکل پذیر و جداسازی چندمرحله ای برای دستیابی به خلوص بالاتر نیز وجود دارد. پس از ابداع میکروفلوییدیک اینرسی، دستگاه هایی با هندسه های متنوعی ساخته شده و استفاده می شوند. از مطرح ترین هندسه ها، کانال های حلزونی شکل می باشند. این کانال ها به دلیل هندسه ی ساده ای که دارند، بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند. شدت جریان نیز در این کانال ها به دلیل ابعاد نسبتا بزرگ و عدم وجود موانع بالا بوده و امکان ایجاد گرفتگی و انسداد در کانال نیز کاهش می یابد. از دیگر مزیت های این طراحی کانال ها، امکان استفاده از روش های تشخیصی دیگر مانند شاخص های آنتی بادی در دستگاه برای بالا بردن دقت آن است. اخيرا امکان اتصال چندتایی کانال های حلزونی شکل به منظور افزایش شدت جریان ورودی و بالابردن سرعت جداسازی مطرح شده است.

از دیگر هندسه های مطرح در میکروفلوییدیک اینرسی، کانال های مسطح با تغییرات ناگهانی سطح مقطع به واسطه ایجاد انبساط و انقباض ناگهانی در مسیر است. تغییر ناگهانی سطح مقطع باعث انحراف جریان شده و اثری مشابه وجود انحنا در کانال و در نتیجه تشکیل گردابه های دین را می دهد. آرایه های انبساط و انقباض در این کانال ها می تواند به صورت متقارن (مشابه مجموعه ای از اوریفیس های متوالی) یا غیرمتقارن(انبساط و انقباض در یک سمت کانال ) طراحی شوند. سازه های غیر متقارن، پیش از کاربری برای جداسازی ذرات، به عنوان مخلوط کننده و متمرکز کننده ذرات و همچنین جداسازی بخش سلولی خون از پلاسما به کار رفته اند.

تصویر دستگاه های جداساز اینرسی1-ساختار مارپیچی، 2- ساختار حلزونی، 3-ساختار مولتی اوریفیس، 4-کانال مسطح با انبساط و انقباض مداوم.

 

 

شرح پروژه:

جداسازی سلول ها بر مبنای خواص بیوشیمیایی یا فیزیکی صورت می گیرد. هر یک از انواع جداسازی دارای مزایا و کاستی هایی است. روش های جداسازی فیزیکی بر مبنای اندازه به دلیل هزینه پایین و سهولت در ساخت اخيرا مورد توجه قرار گرفته اند. در میان انواع روش های جداسازی بر اساس اندازه، روش های میکروفلوییدیک اینرسی به دلیل ساختار ساده ی سیستم، ابعاد نسبتا بزرگ و قابلیت کار کردن با شدت جریان های بالا ویژگی های مناسبی برای یک سیستم جداسازی را در اختیار کاربر قرار می دهند. سیستم میکروفلوییدیک طراحی شده در این پژوهش بر مبنای میکروفلوییدیک اینرسی کار می کند و دارای ساختار مسطح با انبساط و انقباض های متناوب است.

برای جداسازی از روش میکروفلوییدیک اینرسی استفاده می شود. هدف از این کار این است تا سلول های سرطانی در گردش از نمونه خون جداشده و در خروجی ها در یکی محلولی با غلظت بالای سلول های سرطانی و در دیگری گلبول های سفید و قرمز خون مشاهده شوند.

از آنجا که فرض بر این است که تمام سلول های سرطانی در گردش از گلبول های خون بزرگتر هستند، روش جداسازی میکروفلوییدیک اینرسی و جداسازی بر مبنای اندازه می تواند روش بسیار مناسبی باشد. در ابتدا سیال حاوی ذرات و سیال فاقد ذرات از طریق دو میکرو کانال ورودی وارد می شوند. سیال متمرکزکننده نقش مرتب و بر خط کردن ذرات و آماده سازی آنها برای جداسازی و همچنین شستن ذرات ناخواسته در طول مسیر را بر عهده دارد. در این دستگاه باتوجه به نیروهای موثر بر ذرات جداسازی صورت می گیرد. نیروی کشش دین متناسب با توان اول شعاع ذره است و نیروی بالابر اینرسی با توان چهارم شعاع ذره رابطه ی مستقیم دارد. در نتیجه ذرات با شعاع بزرگتر که CTCها هستند، بیشتر تحت تأثیر نیروی اینرسی و ذرات کوچکتر که گلبول های سفید و قرمز و پلاکت ها هستند، تحت تأثیر نیروی دین قرار خواهند گرفت.

اگر سیستم را مشابه شکل زیر مسطح و مجموعه ای از انبساط و انقباض ها در نظر بگیریم، با توجه به این که تشکیل نیروهای دین در قسمت انقباض رخ می دهد، مرکز جرم ذرات کوچکتر (گلبول های سفید و گلبول های قرمز ) که نیروی به سمت دیواره ی 2 کشش دین بر آنها حاکم است نزدیک دیواره 2 و روی خطوط جریان متمرکز کننده قرار می گیرند در حالی که مرکز جرم ذرات بزرگتر(سلول های سرطانی) تحت تأثیر نیروهای بالابر اینرسی که به سمت دیواره ی 1 هستند، از دیواره دور شده و نزدیک به دیواره 1 قرار می گیرند. این نحوهی قرار گیری باعث جداسازی نهایی ذرات می شود.

شکل سیستم میکروفلوییدیک اینرسی مسطح.

در این پروژه از نرم افزار کامسول(COMSOL) استفاده شده است.

 

هندسه مسئله:

 

 

پارامترهای مسئله:

 

مش بندی:

 

نتایج:

نتایج پتانسیل الکتریکی در کانال میکروفلوئیدیک

 

نتایج سرعت:

 

نتایج بدون جداسازی دی الکتروفورز

 

 

نتایج با کمک جداسازی الکتروفورز

 

 

 

نتایج فشار: